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化学成份

灵芝的化学成分——三萜类化合物

添加时间:2006-04-11 09:06:45  浏览次数: 次  :

   三萜类化合物是灵芝的主要化学成分之一,灵芝中的很多三萜化合物具有生理活性,如ganoderic acid A.B.C和D能够抑制小鼠肌肉细胞组胺的释放。Ganoderic acid F有很强的抑制血管紧张素酶的活性。赤芝孢子酸A对CCL4和半乳糖胺及丙酸杆菌造成的小鼠转氨酶升高均有降低作用。赤芝孢子内脂A具有降低胆固醇作用。因此对三萜类化合物的进一步深入研究将有利于灵芝有效成分的寻找和进一步阐明其生理活性。
  1982年Kubota.T等人首次从赤芝子实体中分离得到三萜类化合物,此后十年来,对三萜类化合物最多的是日本,其次是中国(包括台湾)。到目前为止已先后从赤芝子实体和孢子粉中分到了103种新的三萜类化合物。
  一、三萜类化合物提取和分离
  灵芝中三萜化合物的提取分离方法可以分为三类,一类是用甲醇或者乙醇提取原料,提取物直接进行层析分离,如H.Konda等用甲醇提取原料,提取物浓缩后悬浮于水,依次用乙烷、乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯部分经硅胶色谱、高效液相层析(HPLC)分到四个三萜酸。第二类方法是用甲醇、乙醇等提取原料,然后分出总酸部分,进行分离,如Morigiwad等人用70%甲醇提取原料,提取物用1mol/L HCL调pH2—3,再用乙酸乙酯萃取,浓缩后进行分离,分到五个三萜化合物。Nishitoba等人用乙醇提取原料,提取物浓缩后在水和CHCL3中进行分配,CHCL3层浓缩至一定体积后,用饱和的Na2CO3水溶液碱化至Ph9,然后用CHCL3萃取,水层用4mol/L H2SO4酸化至pH2,再用CHCL3萃取液用水洗,Na2SO4干燥,浓缩后得总酸部分,该部分再以常规方法用重氮甲烷进行甲酯化,硅胶柱色谱,得到三个新的三萜酸。
  灵芝中三萜化合物的分离大多是经过反复硅胶柱层析,较纯的部分薄层、抵压柱,高效液相色谱(正反相)制备等方法进行分离纯化。胶硅柱色谱一般常用的展开剂为MeOH-CHCL3,EtOAc-C6H6,EtoAc-acetone,EtOAc-CHCL3,CHCL3-MEOH-H2O等系统。HPLC多用乙酸铵缓冲溶液以及MeOH-H2O洗脱。薄层检查一般使用的展开剂为CHCL3-MeOH(95:5,9:1V)或苯—乙酸乙酯(3:7V/V),香兰醛—硫酸作为薄层斑点的显色剂。
  我们曾从赤芝孢子粉酸性脂溶部分中分到七个三萜化合物,其中五个四环三萜酸,一个四环三萜醇,二个五环三萜内酯化合物,并对它们的结构进行了测定。证明有三个新化合物,其余均为首次从赤芝孢子粉中分离出来。下面是三萜类化合物图分离流程。
  二、三萜类化合物的结构特点。
  (一)三萜类化合物的结构特点
  灵芝三萜类化合物分为四环三萜和五环三萜。从灵芝四环三萜类化合物的结构来看,属于高度氧化的羊毛衍生物。按分子所含碳原子数可分为C30,C27,C24三类。
  在C11位和C23位大部分有羰基,而且在C3、C7、C15位也多被氢基或羰基所取代。在三萜醇、醛、和过氧化物的结构中环上大多存在两个不饱和双键。目前灵芝三萜化合物的命名有些混乱,同一化合物有不同的名称,对此我们采用最早的命名。
  (二)三萜类化合物的光谱特征
  1.红外光谱:灵芝中的三萜类化合物大多都有氢基,因而在3300cm-1,1050cm-1有强的氢基吸收峰。三萜酸类化合物在2600-2400cm-1有弱吸收峰,当羧酸被酯化后这一吸收峰消失。在C15位有羰基的化合物在1740—1760cm-1会出现五元环酮的吸收特征峰。在1720-1(酯),1710cm-1(六元环酮),1650cm-1(αβ不饱和酮)也有较强的吸收峰。
  2.紫外光谱:由于灵芝中的三萜类化合物大多数都有共轭体系存在,因而紫外吸收波长和强度也很有规律,凡有C11位存在羰基的化合物都存在着双键,这类化合物的紫外吸收大多在λmax237nm,244nm,253nm,logε3.7—4.1之间。而在既没有α、β不饱和酮,又没有共轭双键的化合物中,紫外光谱仅表现简单的双键末端吸收在λmax210logε4.2左右。
  3.质谱:四环三萜化合物质谱裂解的共同特征是失去侧建。羊毛烷类的特征裂解是从D环断裂,伴有一个质子的转移,然后经第二次裂解是从D环的一部分。Kikuchi[11]在这方面作了很多研究,总结出这类化合物的裂解方式大致如下:
  4.核磁共振谱:三萜类化合物的HNMR中主要信号是双键质子,连氧碳质子。环内双键质子的δ值一般大于5*10-6,在灵芝三萜化合物中,如ganoderic acid R.S.TX.Y.Me等的双键位置,7位质子的δ值在(5.48—5.86)*10-6之间,11位质子的δ值比7位要处于高场,在δ(5.31-5.39)-10-6之间,侧链上双键的位置可分为二类,一类,20位质子的信号在δ(6.04-6.12)*10-6,如ganoderenic acid A.B.C.D等。另一类,24位质子的信号在δ(5.4-5.7)*16-1,如ganoderol A和B。
  连氧碳质子由于位置、环境和构型的不同,其化学位移变化较大。在C3、C7、C12、C15为羟基取代的化合物中由于羟基构型不同,该碳所连接H的学位移和偶合常数也不同,3—H多为α构型,δ值在(3.22—3.31)*10-6,J=10Hz,7—H为α构型时δ:(4.75—4.85)*10-6,J=9Hz,7-H为β构型时,δ:(4.5-4.9)*10-6。15—H多为β构型,δ(4.2-4.92)*10-6。三萜化合物母核上有较多的取代基,对甲基的化学位移影响较大。18-CH3通常在δ(0.95-1.0)*10-6之间,当分子中存在共轭双键时,该甲基信号向高场位移至δ(0.55-0.60)*10-6,当12位有羟基取代时,该信号出现在δ(0.85-1.0)*10-6之间,为双峰,但当20位有羟基取代时,该信号向低场位移,出现在δ(1.4-1.6)*10-6,当存在双键时,该信号出现在δ2.1*10-6,且都为丹峰。27—CH3通常出现在δ(1.1-1.2)*10-6,当存在双键时,该甲基信号在δ1.6*10-6左右。32—CH3受7位和15位取代基的影响较大。
  当7位和15位同时被羰基取代时,该信号在δ(1.6-1.8)*10-6之间,当7位和15位无取代基时,该甲基信号则出现在δ0.88*10-6左右。30-CH3和31-CH3受3位取代基影响较大,当3位是羰基时,17-H在δ1.8*10-6左右,而当15位是羰基时17-H向低场移至δ2.2*10-6左右。从17-H的位置可以判断C15所连接的基团。
CNMR的运用使得化合物基本骨架的确定日趋准确。三萜化合物的碳谱中最容易分辨的信号来自双键碳原子和连氧碳原子。
  近年来发展起来的1H-1H和1H-13C COSY等二维核磁共振谱已应用在灵芝三萜结构的测定中。
  5.旋光光谱:旋光光谱主要是解决绝对构型问题,从文献报道的CD谱数据总结出CD谱与绝对构型关系:凡是具有[I]式绝对构型者,C7为羟基或羰基取代,CD谱都呈现下列Cotton效应,(290-295)nm(—),(248-257)nm(+),(207-217)nm(-);凡是在[I]式结构中C7为
  酮基者,则不管3位或15位的取代基如何,都呈现如下Cotton效应:(305-307)nm(-),(272-278)(+),(253-256)nm(-),(225-231)nm(+)。
  Nishitoba等人在鉴定epoxyganoderiol A的绝对构型时,应用CD谱确定了C24和C25的绝对构型。在epoxyganoderio A的侧链上存在着一个环氧基团,为了确定24和25位是S还是R,首先,以羊毛醇为原料,经反应得到S和R两种构型的化合物,反应如下:
  分别将7b和7a溶于CCL4溶液中,加入EU(fod)3络合物,测其旋光谱。
  以上两个化合物的CD谱的Cotton效应为25R。在相同条件下测epoxyganoderiol A的CD谱,显示313nm(△ε+10.9)为正Cotton效应,证明25位的绝对构型为S,通过测定NOE,证实24位绝对构型为S。
  (三)结构测定中的化学反应
  随着仪器分析技术、新方法的发展,各类谱学方法和X射线—衍射等分析手段已
在结构测定中得到了广泛的应用。经典的化学方法与仪器分析相结合,使三萜化合物的结构测定快速而准确并达到了微量的水平。化学反应常用于证实分子骨架中取代基类型、数目、位置及构型等。
  1.氧化反应 氧化反应主要用来确定分子中所含羟基、羰基或酰基的数目和位置等。应用较多的将羟基氧化成羰基,比较常用的是铬酐—吡啶,也有将铬酐溶于AcOH中搅拌加入样品中,室温下搅拌2h,用水稀释,氯仿提取,提取液经水洗干燥浓缩后经薄层制备而得到氧化产物。
  2.酰化反应:酰化反应对于确定分子中羟基的数目、性质、构型很有帮助,常用的乙酰化反应,通常采用醋酐—吡啶室温处理的方法。
  3.水解:由于部分灵芝三萜酸中带有乙酰基,为确定乙酰基的存在和数目,采用了水解的方法,如Komoda将ganoderic acid F溶于甲醇,用5%Na2CO3室温处理3h后,用2mol/L HCL酸化,除去甲醇后用CHCL3萃取,水洗CHCL3NaSO4干燥,蒸干。通过TLC制备得水解产物。
  4.还原:还原反应主要用来确定分子中有无不饱和双键及羟基、羰基、取代基的位置。如Nishitoba等人在确定lucidenate G结构时,为了证实C26位上存在着羟基,先将lucidenate G甲基化,然后再用NaBH4进行还原,得到其丙酮化物,从而证实了C26位存在着一个羟基。
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